严格控制实验条件，建立标准化脑缺血动物模型.pdf

中华神经科杂志.gif()中华神经科杂志年No.科技期刊专论严格控制实验条件，建立标准化脑缺血动物模型模拟人类缺血性脑血管病的发病过程，建立重复性好、生理指标控制严格的标准化活体脑缺血动物模型，始终是研究者们所追求的目标。随着缺血性神经元损伤与修复机制研究的日趋深入，对脑缺血动物模型的建立提出了更高的要求。在神经科学飞速发展的今天，尽管谈论脑缺血动物模型的规范化建立不是新话题，但却有重要的现实意义和必要性。纵观国内外有关脑缺血活体研究的相关研究报告可以看出，在脑缺血动物模型的研究，尤其是在动物模型制作过程中各种生理指标以及影响因素的控制方面，我们与国外存在较大的差距。这不仅影响到国内脑缺血病理生理机制的深入研究，不利于我国中药脑保护剂确切疗效的评价，同时由于我们活体动物实验可控制条件与国外有较大的差距，因此，我们的研究结果无法得到国外同行们的普遍认可，研究论文也难以到国际一流杂志上发表和交流。如何在现有的条件下建立标准化、规范化的脑缺血动物模型，并合理的、选择性的将其用于脑缺血损害的基础研究是值得探索的问题。

分析目前国内脑缺血动物模型研究及应用的现状，仍然存在盲目选择动物模型的类型、麻醉剂使用不当、生理指标及影响因素控制不严以及模型成功与否评判标准不一等现象。究其原因，除了与部分研究单位研究经费有限，无力匹配相应实验动物监控装备外，主要是由于少部分研究人员就各种生理指标及影响因素对脑缺血研究的影响认识不够，对各类脑缺血模型的形成原理以及特色认识不清，致使模型的选择及制作过程不规范，导致研究结论矛盾较大，重复性差。目前，该现象已引起了国内科研管理机构以及专家们的普遍重视。1997年国家自然基金重点项目“缺血性神经元死亡机制及干预措施研究”的招标指南上明确提出了建立“标准化脑缺血动物模型”的要求。所谓脑缺血动物模型的标准化和规范化，我们认为主要应该从以下几个方面着手展开。一、合理选择实验动物及实验模型由于大鼠具有成本低、种系内纯合性好以及与人类有类似的脑血管解剖特性等优点,因此，到目前为止，大鼠仍为脑缺血研究的常用实验动物。此外,我们体会到大鼠具有极强的抗感染能力和生命力,常规操作一般不会引起伤口继发性感染,而且动物存活时间相对较长，这些特性也给研究带来了方便。在不同的大鼠品种之中，-344大鼠大脑中动脉(M)后形成的脑梗死体积一致性好；-yoto大鼠变异相对较大,而-大鼠居于二者之间。

蒙古种沙土鼠缺少连接颈动脉和椎-基底动脉系统的后交通动脉,用其制作单侧或双侧颈动脉(C)结扎脑缺血模型较为理想。此外，研究者也可根据研究的目的选用兔、猫、狗和灵长类等大型动物作为研究对象。国外近期有人提出，猪的脑血管解剖特性与人类相似，而且侧支循环较少，比较适合于脑血管病的基础研究。脑缺血模型的正确选用是标准化的前提和基本条件。合理选用动物模型不仅能针对其特点扬长避短，而且还可以达到突出研究目的的作用。在脑缺血模型的具体选用过程中，首先要明确所选用模型的形成原理和特点,然后再根据其原理结合实验所需达到的目的来选用。M模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型。血管内直接线栓闭塞法（线栓法）M模型，因具有不开颅、效果肯定且可准确控制缺血及再灌注时间的优点，因此，用其研究神经元对缺血的敏感性、耐受性以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时该模型对动物全身的生理功能影响较小，动物存活时间长，也适用于慢性脑损伤的研究，近几年该模型得到研究者们的偏爱。但值得注意的是，该模型实际上是机械性人工栓塞性卒中,与人群常见卒中发病过程存在差异。而且其手术操作过程较为复杂,许多细节如动物的品系和体重、栓子粗细以及插入深度处理不恰当均会明显影响实验结果。

微栓子栓塞法脑缺血模型，由于其不能预见缺血部位和范围，不能再通，因此，仅限于溶栓治疗以及血小板微血栓形成后的脑病理改变等一些特殊研究。开颅机械闭塞M模型模拟了永久性栓塞性人类卒中，由于开颅影响了颅内压力平衡以及动物的咀嚼功能，而且手术复杂、不能再灌注及感染机会较多，使其应用受到限制。但该模型尤其是Kader改进后的电凝法M模型，也是目前国际上应用最广泛的经典局灶性脑缺血模型，适用于缺血后神经功能缺损、药物及康复治疗疗效评估等方面的研究。另外，光化学诱导的脑缺血模型也是研究者们通常选用的模型之一。该模型的独特之处是其形成过程与人类脑血栓形成过程及其机制比较接近。国外学者研究发现，光化学诱导血栓形成过程中，由于其同时启动了血栓形成后的缺血性脑损伤系统和血栓形成过程中的血管内皮受损-凝血纤溶系统，因此，脑组织病理损害程度较其他脑缺血动物模型更为严重。该模型适用于研究抗血小板药物、抗血栓药物file:///F|/qk/zhsjk/.htm1／3页）2009-12-2313:44:14中华神经科杂志和内皮细胞保护剂药物疗效的研究。此外，光化学诱导皮质脑缺血模型还具有皮质梗死面积和深度可调，损伤范围大小一致，可选择性制作不同部位梗死等特点，为皮质功能定位研究提供了条件。

到目前为止，在所有的局灶性脑缺血模型中，光化学诱导皮质脑缺血模型的动物存活时间最长。近几年来，脑缺血的基础病变和危险因素日益受到重视，使用自发性高血压大鼠(,SHR)、老龄大鼠制作脑缺血模型或直接选用卒中型自发性高血压大鼠(SHR-,SHR-SP)进行脑缺血研究被大力提倡，以上大鼠尤其适用于脑血管病分子机制、遗传特性以及危险因素方面的研究。但此类实验动物目前所需费用较高。二、严格控制实验条件和干扰因素大量动物实验研究结果证实，实验条件和周围环境因素的改变对实验结果有明显的影响，如麻醉剂的选择、环境温度、动物血糖、血气及平均动脉压的控制等。如何在动物实验研究过程中严格控制实验条件？哪些实验条件必须得到控制？脑缺血活体研究过程中动物是否需要使用呼吸机？我们体会到注意以下措施的使用可使动物实验条件得到较好的控制。1.合理选用麻醉剂:脑缺血动物模型均是建立在动物麻醉的基础上，这与人类脑血管病的发生情况不同，因此，需严格除外麻醉剂对实验结果的影响。目前，国内多采用动物一般状态下的水合氯醛、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠或乌拉坦麻醉。

而大量研究结果表明，全身麻醉剂可直接或间接影响脑血流、颅内压、脑代谢以及神经递质的传递模型的过程中，观察了以上麻醉剂对大鼠呼吸、肛温、脑温、心电图、动脉血压及血气等指标的影响，结果发现，水合氯醛、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠或乌拉坦对istar大鼠以上生理指标均有不同程度的影响。常规麻醉量的苯巴比妥钠、乌拉坦可使脑温明显下降；而水合氯醛、苯巴比妥钠则可使大鼠呼吸频率下降50%，致使动物出现明显的酸中毒和二氧化碳潴留，其中戊巴比妥钠对大鼠生理指标影响最小。人工辅助通气可使麻醉剂对大鼠生理指标的影响得到明显矫正 。目前，国际上脑缺血研究通用的麻醉方案是使用肌松弛药及人工辅助通气状态下的氟烷吸入麻醉，且术中连续监测心电 图、血压及血气。整个过程接近人类的手术麻醉过程。我们在脑缺血动物实验过程中以空气为气源，给予动物 人工辅助通气，术中控制好呼吸频率及潮气量，采用戊巴比妥钠麻醉也达到了较为理想的效果。在缺乏以上条 件的实验室，我们推荐使用2% 戊巴比妥钠，45 g/kg体重腹腔注射麻醉。实验中出现严重呼吸困难或有明显呼吸暂停的鼠除外。 2.控制实验环境温度、动物血糖、血氧及血气水平:在实验的干扰因素中，尤以环境温度、动物血糖以及血 气水平对脑功能的影响最为明显。

脑缺血动物模型制作过程中，脑温对实验动物的影响来源于两个方面，首先 常规使用的麻醉剂可使脑实质温度明显下降，从而产生了亚低温脑保护作用；另一方面，如周围环境或手术局 部温度过高，致使脑实质温度上升，对脑细胞产生明显的损伤作用。因此，在脑缺血病理机制尤其是脑保护措 施的研究过程中，应重视环境温度对实验结果的影响，尽量选用对脑温影响较小的麻醉剂，如戊巴比妥钠和水 合氯醛，保持环境温度在25～30左右。注意：实验鼠的肛温不能准确反映脑实质温度，有条件应直接监测深 部脑实质温度。近几年的研究结果证实，局灶或全脑性脑缺血时动物血糖轻度升高，而高血糖本身可使脑梗死 面积明显增加。为了控制动物血糖水平，可在实验前禁食12～24小时。 低氧血症、酸中毒对脑组织代谢尤其是脑血管的舒缩功能影响较大，而研究者研究的目的本身就是了解缺 血、缺氧对神经元的损害机制，因此，脑缺血的基础研究对实验动物的血气、血氧以及血液酸碱度的要求就更 为严格。人工辅助通气是保证以上指标在正常生理范围内的最佳手段。我们体会到，在开颅法制作脑缺血模型 时或在线栓法等较为复杂的模型制作过程中，应考虑应用人工辅助通气。而光化学诱导皮层脑缺血模型或单纯 颈动脉结扎再灌注模型，由于制作过程本身对动物生理指标影响较小，可不进行人工辅助呼吸。

总之，无论选 用何种类型脑缺血模型，均要考虑到以上干扰因素对实验的影响，在总体实验开展之前要对选用的实验体系进 行客观评估和调整。 三、规范化的实验方法 国外有研究报道，制作线栓法M 模型时，用不同规格的线栓、插入不同的深度，则脑梗死面积有明显的差异 的不同部位或光照不同的时间，脑梗死面积甚至模型的成功率有明显不同。 模型在实验技巧上要求较高，不同实验室应用该方法制备的模型在成功率、梗死体积、蛛网膜下腔出血（SA ）发生率及动物早期死亡等方面均有一定的差异。国外学者研究证实，以上差异是由于动物的品系和体重，尼龙线栓直径、强度、弹性及头端大小以及插入深度不同 所造成 。此外，该方法本身对大鼠月龄及体重的要求也非常严格。常用标准4-0的尼龙单线丝（和）只适用于体重280～350 g的大鼠，超出该范围的大鼠则不宜选用该模型或需重新建立实验方法及标准。 在脑缺血的研究过程中，研究者们为了模拟人类脑血管疾病的发病过程，往往期望选用老龄大鼠作为研究对 象，但由于老龄大鼠的M 模型。近期，Wang等 模型不宜选用老龄大鼠为实验对象。此file:///F|/qk/zhsjk/.htm 2／3页）2009-12-23 13:44:14 中华神经科杂志 外，笔者发现部分研究人员在建立线栓法M 发生率较高，可能是由于操作不当，动作粗糙所致。

光化学诱导皮层脑梗死模型以制作方法简单、重复性好为其优势，但局部光照强度的稳定性以及 光照局部温度却往往容易被忽略，后者如控制不好则可造成局部脑组织热损伤。因此，该模型不仅应采用冷光 源，而且光源需要效果肯定的降温系统，以保证局部光照温度低于37。此外，最好每次模型制作前用光强度 测定装置测定光源的强度，保持其恒定在0.56 左右。四、展望 综观国内外的研究现状可以看出，目前脑血管疾病基础与临床研究又达到了一个前所未有的新高峰。缺血 性神经元损伤与修复机制的研究已由整体水平发展到细胞、分子水平，由细胞外、核外相关事件的研究深入到